三毛猫のオスが極めて珍しいとされる背景には、猫の毛色を決定する遺伝子と性染色体の切っても切れない関係があります。猫の性別は人間と同様、「XX」であればメス、「XY」であればオスになります。この基本的な生物学的ルールが、三毛猫の出現確率を劇的に絞り込む最大の要因です。
猫の毛色において、「オレンジ（茶・赤）」を発現させるO遺伝子（Orange遺伝子）は、性染色体のうちX染色体の上にのみ存在します。O遺伝子には、茶毛を発現させる優性の「O」と、茶毛を発現させない（黒やキジトラなどのベースカラーになる）劣性の「o」の2種類があります。
白・黒・茶の3色が同時に現れる三毛猫になるためには、大前提として「茶を発現するX（O）」と「茶を発現しないX（o）」の両方を併せ持つ必要があります。メス（XX）の場合、遺伝子型が「X(O)X(o)」の組み合わせになれば、受精卵の発達段階で細胞ごとにどちらか一方のX染色体がランダムに休止する「X染色体の不活性化（ライオニゼーション）」が起こります。これにより、ある部分は茶色、別の部分は黒色となり、さらに常染色体上にある白斑遺伝子（S）が加わることで、見事な3色の毛並みが完成します。
しかし、通常のオスは「XY」であるため、X染色体を1本しか持っていません。遺伝子型は「X(O)Y（茶＋白）」か「X(o)Y（黒＋白など）」の二者択一となり、茶と黒が同時に発現することは原理的に不可能です。この生物学的な壁を突破してオスの三毛猫が誕生する確率は、統計的・遺伝学的な観測から約3万分の1（0.003%程度）と算出されています。
