テーブルに並ぶ12使徒は、キリストを中心として左右に3人ずつ、合計4つのグループに整然と分けられています。キリスト教における神聖な完全数「3（三位一体）」と「4（四季・四元素・福音書）」を掛け合わせた「12」という構造は、感情のカオスを描きながらも全体として完璧な調和を保つための数学的仕掛けです。
左端から右端への使徒の並びと、それぞれの役割・リアクションを整理すると以下のようになります。
【左端グループ：驚愕と立ち上がり】
・バルトロマイ：テーブルの左端で身を乗り出し、何が起きたのかを凝視している。
・小ヤコブ：ペテロとバルトロマイの間から手を伸ばし、動揺を隠せない様子。
・アンドレ：両手を胸の前に掲げ、「自分ではない」と拒絶のポーズをとる。
【中央左グループ：疑惑・裏切り・怒り】
・ペテロ：激情に駆られ、右手にパン切りナイフを握りしめながらヨハネに詰め寄る。
・ユダ：キリストの予告にギクシャクとのけぞり、右手に銀貨30枚の報酬が入った小袋を握りしめている。
・ヨハネ：キリストの左隣（向かって右）で悲しみに打ちひしがれ、首を傾けてペテロの言葉に耳を傾ける。
【中央右グループ：嘆き・弁明・困惑】
・トマス：人差し指を天に向けて掲げ、「主よ、本当ですか」と疑問を投げかける。
・大ヤコブ：両腕を広げてショックをあらわにし、キリストの言葉を制止しようとする。
・フィリポ：胸に両手を当て、キリストに向けて自らの潔白と忠誠を必死に訴える。
【右端グループ：議論と情報交換】
・マタイ：両手をキリストの方向へ向けながら、顔は右側の2人に向けて真相を議論する。
・タダイ（ユダ・タダイ）：不可解な表情でシモンに問いかける。
・シモン：テーブルの右端で両手を広げ、事態の深刻さに思案を巡らせている。
ここで最大の注目ポイントとなるのが裏切り者ユダの見分け方です。ユダはペテロとヨハネの間に挟まれる形で描かれていますが、注意深く観察するとダ・ヴィンチが仕掛けた「裏切り者の証拠」が浮かび上がります。
第1に、ユダの右手にはイエスを引き渡した代償である「銀貨30枚が入った革袋」が固く握られています。第2に、ユダの右肘のすぐそばには、動揺のあまり倒してしまった「塩壺」が描かれており、西洋の不吉な予兆を象徴しています。そして第3に、他の使徒たちが窓からの光を受けて明るく照らされているのに対し、ユダの顔だけが濃い影に沈み、姿勢もキリストからわずかに身を引くような不自然な角度をとっている点です。光と闇の対比によって、ダ・ヴィンチはユダの精神的孤立を残酷なまでに浮き彫りにしています。
